ISOLASI BAKTERI
ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi bakteri terhadap
sampel air kran, air akuarium, insang ikan lele, usus ikan lele, dan ikan peda
dengan media TSA (Tryptic Soy Agar) pada tanggal 1 Juni sampai 6 Juni 2011 di
Laboratorium pengolahan Jurusan Perikanan Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.
Metode yang digunakan yaitu metode penggoresan kuadran. Isolasi bakteri
merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Tujuan
praktikum isolasi bakteri dari lngkungan akuatik adalah untuk mempelajari cara
mengisolasi bakteri dari lingkungan akuatik dengan metode penggoresan
kuadran serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri tumbuh. Dimana setelah
dilakukan isolasi terjadi perbedaan jumlah koloni pada air kran 13 koloni, air
akuarium 40 koloni, insang ikan lele 30 koloni, usus ikan lele 3 koloni dan
ikan peda tidak tumbuh koloni. Serta perbedaan ciri-ciri koloni dari ukuran
yang tebal, tipis, serta warna koloni yang tumbuh pada sampel.
Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan
isolasi dilakukan dengan cara mengambil sampel mikroba dari lingkungan yang
ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian dikultur/dibiakan dengan
menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang ingin
dicapai. Untuk mendapatkan atau menumbuhkan jenis
mikroorganisme tertentu, maka dilakukan isolasi. Dengan isolasi inilah dapat
diidentifikasi jenis bakteri tertentu baik dari kelimpahan maupun morfologinya.
Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan
mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan
murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari
pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986). Kultur murni atau biakan
murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk menelaah dan
mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural,
morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang
terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Sebelum
mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya
menentukan sampel dan media apa yang akan digunakan.
Ada beberapa metode untuk memperoleh
biakan murni dari suatu sampel tertentu. Dua diantaranya yang paling
sering digunakan adalah teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua metode ini
didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian
sedangkan sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya, dengan
anggapan bahwa koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah diinkubasi
berasal dari satu sel tunggal. Dan metode lain yang digunakan yaitu cara sebar
(spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta mikromanipulator (the
micromanipulator method) (Lim, 1990). Isolasi bakteri dalam dunia perikanan
sangat bermanfaat untuk mengidentifikasi jenis bakteri yang terdapat pada ikan
terutama dalam bidang budidaya dan pengolahan. Dengan cara pengambilan sampel
dari jenis ikan air tawar maupun ikan air laut. Identifikasi bakteri yang
diisolasi biasa terdapat pada insang ikan, usus ikan, daging ikan maupun
kondisi perairannya. Tujuan praktikum dari isolasi bakteri yaitu mempelajari
cara mengisolasi bakteri dari lingkungan akuatik dengan metode penggoresan
kuadran serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri tumbuh.
Pembiakan dan identifikasi bakteri
bersumber dari spesimen yang merupakan hasil proses infeksi, sedangkan infeksi
itu sendiri dapat berasal dari berbagai sumber,beberapa tahapan terjadinya
proses infeksi :
§
Infeksi memerlukan tempat masuk yang
sesuai (port of entry) misalnya saluran pernafasan, saluran pencernaan,
kontak langsung, gigitan serangga.
§
Tempat masuknya bakteri biasanya
spesifik terutama untuk bakteri patogen, bakteri harus tumbuh dan berkembang
dalam tubuh hospes dan menyebar melalui system limfa dan aliran darah menyebar
ke seluruh jaringan,
§
Penyebaran infeksi memerlukan jalan
keluar unuk menginfeksi hospes lainnya (port of exit). Istilah mikroorganisme yang biasanya
merupakan penyebab penyakit disebut patogen dan patogenitas adalah kemampuan
mikroorganisme menyebabkan sakit. Virulensi berhubungan dengan derajat
patogenitas bakteri. Patogenitas dan virulensi berkaitan dengan penyebaran atau
toksigenitas. Penyebaran artinya kemampuan bakteri untuk masuk untuk masuk ,
menyebar dam berkembangbiak di dalam jaringan hospes. Toksigenitas berhubungan
dengan kemampuan bakteri menghasilkan toksin. Virulensi dinyatakan dengan LD50
yaitu konsentrasi mikroorganisme yang menyebabkan 50 persen hewan percobaan
sakit. Proses ketika mikroorganisme patogen masuk dikenal dengan infeksi,
selama proses ini hospes dapat menjadi sakit, infeksi terselubung atau sehat
menjadi carrier
Aspek patogenitas bakteri
Patogenitas bakteri terutama disebabkan
oleh adanya kapsul pada bakteri tersebut, bakteri yang tidak berkapsul lebih
mudah untuk difagosit oleh sel leukosit. Hilangnya kapsul bakteri berhubungan
dengan hilangnya virulensi bakteri karena kapsul diketahui sebagai faktor
pengganggu. (contohnya bakteri pneumococcus)
Toksin bakteri
Toksin bakteri diketahui memiliki
peranan penting dalam kemampuan bakteri menimbulkan penyakit. Toksin dibagi
dalam kelompok eksotoksin dan endotoksin.
a. Eksotoksin
Eksotoksin di hasilkan oleh bakteri
ke lingkungan dan potensial serta spesifik untuk jaringan hospes, kemampuan menghasilkan
eksotoksin biasanya pada bakteri gram positif batang seperti Clostridium
dan Corynebacterium. Eksotoksin merupakan antigen kuat, tidak tahan
panas, merupakan substansi protein, hancur oleh enzim proteolitik kecuali Clostridium
botulinum, efek toksin dapat hancur oleh formalin, panas dan penyimpanan
yang lama tetapi tidak untuk sifat antigeniknya, contohnya toxoid untuk program
imunisasi
b. Endotoksin.
Endotoksin ditemukan intraseluler,
terdapat pada dinding sel bakteri dan toksin ini dilepaskan oleh bakteri
setelah bakteri hancur, endotoksin biasanya berhubungan dengan bakteri gram
negatif dan bersifat antigen lemah. Endotoksin bersifat tahan terhadap panas,
polisakaridanya tidak dapat dicerna oleh enzim proteolitik, endotoksin bersifat
toksin lemah dan menginduksi reaksi demam pada hospes dan dapat menyebabkan
syok
Enzim ekstraseluler
Beberapa mikroorganisme memproduksi
enzim ekstraseluler yang ikut berperan dalam patogenitas, enzim tersebut
adalah:
a. Enzim koagulase, berhubungan dengan patogenitas Staphylococcus.
Uji koagulase dilakukan menggunakan plasma menyebabkan terjadinya koagulasi.
b. Kolagenase adalah enzim yang dibentuk oleh Clostridium,
bersifat dapat menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri menyebar ke
jaringan
c. Hialuronidase adalah enzim yang diketahui sebagai faktor
penyebaran bakteri. Enzim ini diproduksi oleh Staphylococcus, Clostridium,
Streptococcus dan Pneumococcus.
d. Streptokinase dikenal pula sebagai enzim fibrinolisin,
diproduksi oleh Streptococcus, Staphylococcus, dan Clostridium
perfringens. Streptokinase merupakan enzim proteolitik plasma yang disebut
plasmin, plasmin dapat melarutkan plasma yang terkoagulasi dan aktifitas
tersebut memungkinkan bakteri menyebar
e. Hemolisin merupakan kelompok substansi terlarut yang
diproduksi oleh Staphylococcus, Pneumococcus, beberapa Clostridium,
dan Steptococcus, hemolisin bersifat merusak jaringan. Streptolisin
memiliki kemampuan melisiskan eritrosit.
f. Leukosidin dalah substansi yang merusak leukosit, mereka diproduksi
oleh streptococcus dan staphylococcus
Bakteri berdasarkan kebutuhan
energi, dibagi dalam dua kelompok, yaitu
Ø
Bakteri autotrof
Bakteri autotrof memperoleh energi
dan tumbuh pada anorganik media, membutuhkan karbondioksida sebagai sumber
karbon
Ø
Bakteri heterotrof
Bakteri heterotrof mendapatkan
energi dari sumber karbon organik.Bakteri heterotrof membutuhkan penambahan
gula, asam amino, purin, pirimidin dan vitamin pada media kultur. Fermentasi
gula merupakan sumber energi utama
Morfologi bakteri
Ukuran bakteri coccus berdiameter 1
micron (μ), bakteri batang memiliki lebar 0.5 μ dan panjang of 2 μ, sedangkan
spirochaeta berbentuk ulir dengan lebar 0.2 μ dan lebar 10 μ.
Bentuk-bentuk bakteri:
Struktur bakteri
Struktur umum bakteri terdiri dari
Ø
Dinding sel
Ø
Membrane sitoplasma
Ø
Sitoplasma
Ø
Inti
Struktur khusus bakteri:
Ø
Kapsul, merupakan substansi
eksretori, sebagai benteng pertahanan melawan fagositosis oleh sel darah putih
dan penetrasi virus
Ø
Flagel , berasal dari protein
elastin yang berada di sitoplasma dan keluar badan bakteri berfungsi sebagai
organ pergerakan
Ø
Spora, bentuk vegetatif bakteri
untuk bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan
Ø
Inclusion bodies, vakuola yang
berfungsi sebagai tempat sisa material di sitoplasma
Metode
mikroskopis adalah merupakan upaya mendapatkan informasi sementara terhadap
bakteri penyebab infeksi, akan tetapi pembiakan biasanya diperlukan untuk
identifikasi secara pasti dan mengenal sifat bakteri.Tujuan dari pembiakan
bakteri adalah terdiri dari tiga tujuan utama yaitu:
1) Untuk menumbuhkan dan mengisolasi seluruh bakteri yang ada
dalam spesimen
2) Untuk penentuan jenis bakteri mana yang pertumbuhannya
paling menyerupai bakteri penyebab infeksi dan bakteri mana yang sepertinya
merupakan kontaminan
3) Untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang cukup terhadap
bakteri yang sesuai secara klinik sehingga dapat diidentifikasi sesuai sifat
pertumbuhannya
Media perbenihan
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah
suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang
diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan
nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen
sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi
kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai
kebutuhan bakteri. Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan
nutrisi yang berbeda pula , sehingga dikembangkan berbagai macam media
pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi.
Media perbenihan terdiri dari dua bentuk
yaitu bentuk cair dan padat (agar). Pada media cair, bahan-bahan gizi
dilarutkan dalam air sehingga pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan
warna madia menjadi keruh, semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh
larutan. Diperlukan jumlah bakteri 106 sehingga dapat terlihat
adanya pertumbuhan tanpa mikroskop. Media padat dibuat dengan penambahan bahan
pengeras pada campuran bahan gizi dan air. Biasanya digunakan agarosa yang
memiliki sifat cair pada suhu ≥ 95⁰C tetapi berbentuk padat pada suhu dibawah 50⁰C. Dengan kondisi inkubasi yang
sesuai bakteri dapat tumbuh dan berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga
dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan bakteri membentuk
kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut koloni, dengan kata
lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya memiliki
karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang terdiri dari
satu macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni. Pembiakan yang
murni diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk memudahkan pengambilan
koloni yang sama ketika ditanam pada media identifikasi
1. Bahan dasar
a. Air (H2O) sebagai pelarut
b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media.
Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu
45⁰C.
c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari
kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu
menguraikannya dibanding agar.
d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya
juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media
bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu
berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg
b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa
organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof
memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein
dan asam organik.
c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa
bernitrogen lain dan sejumlah vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan
tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu,
misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator
perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik
ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
4. Bahan lain yang sering digunakan
dalam pembuatan media
a. Peptone,
peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti
otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya
tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
b. Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari
otak,limpa, plasenta dan daging sapi.
c. Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti
atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap &
vitamin (Bcomplex).
d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya
pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol,
dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Klasifikasi dan fungsi media:
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Ø
Medium padat yaitu media yang
mengandung agar 15% sehingga setelahdingin media menjadi padat..
Ø
Medium setengah padat yaitu media
yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat,
tidak begitu cair. Media semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan
mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran
sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen
free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di
bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah
hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen,
misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen
meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh
merata diseluruh media.
Ø
Medium cair yaitu media yang tidak
mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose
Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)
2. Medium berdasarkan komposisi
Ø
Medium sintesis yaitu media yang
komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose
Agar, Mac Conkey Agar.
Ø
Medium semi sintesis yaitu media
yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato
Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk
bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail
tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Ø
Medium non sintesis yaitu media yang
dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya
langsung diekstrak dari bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain
Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Ø
Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa
esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Ø
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi
juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan
pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.
Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang
E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline.
Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus
agalactiae yang toleran terhadap garam.
Ø
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang
mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen
kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat
selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak
hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan
komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum
Agar, buffer charcoal yeast extract agar yang mengandung L-cystein dan
bahan gizi lain untuk pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit
legionnair.
Ø
Media untuk menentukan kebutuhan
nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk
mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s
Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan menggunakan asam
sitrat sebagai sumber karbon.
Ø
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk
mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator
ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate
Broth, Lactose Broth,Arginine Agar.
Ø
Media diferensial
Media ini bertujuan untuk
mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama tumbuh dalam media
perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih
Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna
media di sekeliling koloni, media Mac conkey agar merupakan media diferensial
dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.
Dari
sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk
identifikasi bakteri adalah :
1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.
BHI adalah media penyubur yang
berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik bentuk cair maupun agar.
Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah pepton, buffer
posfat, dan sedikit dekstrosa. Penambahan karbohidrat memungkinkan bakteri
dapat menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya digunakan untuk
media pertumbuhan spesimen darah
2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth).
Media selektif gram negatif
digunakan untuk pembiakan bakteri patogen saluran pencernaan ( salmonella
spp dan shigella spp) dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi
beberapa bahan aktif termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang
menghambat pertumbuhan organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan
bakteri gram negatif. Untuk mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah
diinkubasi 6-8 jam setelah penanaman pertama harus diisolasi ulang dan
diinkubasikan kembali, apabila melewati waktu tersebut bakteri nonenterik
patogen akan tumbuh melampaui pathogen
3. Columbia CNA mengandung darah
Agar
Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber pepton dan
darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat membedakan
reaksi bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah. CNA adalah
merupakan antibiotic Colistin (C) dan Nalidixic acid (NA) yang ditambahkan ke
dalam media untuk menghambat mikroorganisme gram negatif dan menumbuhkan
bakteri gram positif. Contohnya untuk perbenihan Lactobacillus spp dari
specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan infeksi pada vagina dan
wanita hamil.
4. Hektoen
Enteric agar (HE)
Terdiri dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue
dan fuchsin acid) untuk memperlambat bakteri non patogenik gram negatif
batang yang terdapat di saluran pencernaan dan memberi kesempatan salmonella
dan shigella tumbuh. Media HE juga merupakan media differensial karena bakteri
non enterik patogen akan tumbuh koloni berwarna oranye sampai merah muda
kekuningan. Koloni ini timbul dari organisme yng memiliki kemampuan menfermentasi
laktosa dalam media, kemampuan meragi menghasilkan asam yang akan menurunkan pH
media dan meyebabkan perubahan indikator bromthymol blue. Shigella tidak meragi
laktosa sehingga sehingga warna media biru kehijauan tidak berubah seperti
karakteristik media diferensial, media mengandung feri ammonium sitrat yang
mendeteksi adanya produksi gas H2S seperti salmonella spp. Dapat
terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada media.
5. Mac
conkey agar
Mac conkey agar adalah media
selektif dan differensial yang paling sering digunakan. Media ini terdiri dari
zat warna Kristal violet untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan
jamur dan memungkinkan beberapa macam bakteri gram negatif batang tumbuh ,
netral red sebagai pH indikator memberikan warna pink sampai merah pada koloni
misalnya salmonella spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa
misalnya shigella spp memberikan warna koloni jernih transparan
6. Phenyl
ethyl alcohol (PEA)
PEA adalah agar darah domba yang
ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram
negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan nutrisi untuk bakteri
gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan
staphylococcus
7. Perbenihan
cair tioglikolat
Perbenihan cair tioglikolat adalah
media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi seperti casein, ragi dan
ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat pertumbuhan , bahan lain
yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi (resazurin), dextrose, vitamin K1
dan hemin biasa ditambahkan pada media modifikasi thayer martin sebagai
tambahan pada media ditambahkan 0,075% untuk mencegah pengaruh oksigen langsung
terhadap larutan , bahan tambahan ini diberikan untuk memberikan suasasana
anaerob pada bagian dasar tabung sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh
8. Agar
darah
Gambar 2. Agar darah steril (kiri),
α- hemolisa (tengah) dan β-hemolisa (kanan)
Agar darah merupakan media yang
paling banyak digunakan unuk penanaman bakteri yang sukar tumbuh karena pada
agar darah domba mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri. Kemudian pula
koloni yang tumbuh pada media ini biasanya spesifik dan mudah dikenali. Media
pada dasarnya terdiri dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan
(mengandung KH),NaCl, agar dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim
ekstraseluler yang dapat melisiskan sel darah merah domba pada agar
(hemolisis). Aktifitas ini ditandai dengan adanya zona jernih disekeliling
koloni (beta hemilisis), kehijauan (alpha hemolisis) dan untuk bakteri yang
tidak menghemolisa darah tidak terjadi perubahan pada sekeliling koloni bakteri
( gamma /non hemolisis)
9. Agar coklat dan Thayer martin
Agar coklat sama seperti agar darah
tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan terlebih dahulu
sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit
mengeluarkan bahan-bahan intraseluler seperti haemoglobin, hemin,dan koenzim nicotinamide
adenine dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar
tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna coklat pada media sehingga disebut
dengan agar coklat. Biasanya bakteri patogen yang tumbuh pada media agar coklat
yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus spp (terlibat dalam
infeksi saluran pernafasan dan telinga)
Agar Thayer martin
Thayer martin agar adalah media
diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae. Penambahan
antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif, vancomisin
untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan ragi.
Antibiotik trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus
spp, dan bakteri lainnya yang akan tumbuh menyebar di seluruh permukaan
agar dan dapat meghalangi koloni bakteri yang akan diidentifiasi Neisseria
spp. pada mredia modifkasi Thayer martin lewis, antibiotik nistatin diganti
dengan ansamisin
Sterilisasi media
Bahan media yang telah dilarutkan ,
baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan terlebih dahulu melalui
proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan
berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap
air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2
atm dan dengan suhu 121⁰C (250⁰F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda
adalah 15 pon tiap inchi2 (15
Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama
15 menit. dan waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121⁰ C . Setelah di autoclave media
harus mencapai suhu sekurangnya 50 ⁰C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya 25
ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti
darah, antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin
sebelum dituang ke cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas
dapat dilakukan sterilisasi dengan cara filtrasi membran
Lingkungan yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan mikroba
Kondisi lingkungan yang optimal akan
mendukung pertumbuhan bakteri pada media pembiakan, empat faktor lingkuangan
yang paling penting, yaitu:
a) Tersedianya
oksigen atau karbondioksida
Kebanyakan bakteri klinik adalah
terdiri dari bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob obligat. Bakteri
aerob adalah bakteri yang menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron.
Bakteri anaerob fakultatif dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Tetapi
untuk bakteri seperti Pseudomonas spp, Neisseria spp, Bordetela spp,
Brucella spp dan Francisella spp adalah bakteri obligat aerob yaitu bakteri
yang tidak dapat tumbuh tanpa ada oksigen. Sedangkan bakteri yang membutuhkan
oksigen dalam jumlah sedikit disebut bakteri mikroaerofilik
b) Suhu
Bakteri pathogen biasanya tumbuh
sangat baik pada suhu yang sama dengan suhu jaringan dan organ tubuh hospes
yaitu 37C walaupun demikian suhu pembiakan biasanya berada pada rentang 35-37C.
akan tetapi beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya
mislnya: campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia
enterocolitica (dapat tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C
c) pH
pH adalah pengukuran konsentrasi ion
hydrogen pada lingkungan mikroorganisme.nilai pH 7 menunjukkan kondisi netral,
sedangkan pH lebih kecil dari 7 disebut asam dan lebih besar dari 7 disebut basa.
Kebanyakan bakteri klinik menyukai kondisi pH diantara pH netral sekitar
6,7-7,5, kebanyakan media yang diperjualbelikan telah mengandung buffer
sehingga pengecekan ph sudah tidak diperlukan lagi
d) Kelembaban
Air merupakan komponen yang sudah
terdapat dalam media, baik pada media padat ataupun cair tapi untuk penyimpanan
dalam jangka waktu yang lama saat pembiakan bakteri akan menyebabkan kehilangan
sebagian besar kadar air yang timbul karena proses evaporasi. Kehilangan air
dari media dapat mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu:
o berkurangnya
air yang merupakan komponen penting yang akan digunakan untuk metabolisme
bakteri
o dengan
berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam media akan meningkat,
dengan meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan meningkatkan tekanan osmotik
sehingga akan menekan sel bakteri dan sel akan lisis
Isolasi bakteri
Isolasi
atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi
(lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan
tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media,
pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada
dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk
identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan pemindahan bakteri dari
lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang
dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo
bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk
pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus
dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di laboratorium. Dengan demikian
sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan lingkungan yang
sesuai untuk pertumbuhan bakteri
Di
dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi
terdiri dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri
patogen perlu dilakukan isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat
diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat
dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Untuk
memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang
aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai
sebagai penyebab infeksi.
Inkubasi
Metode-metode yang digunakan untuk
mengoptimalkan kondisi inkubasi :
inkubasi
dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-37⁰C) dan kelembaban udara yang
mengandung CO2 sekitar 3-5%
untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak
diperlukan inkubasi pada tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium
bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang sangat erat akan menghasilkan
CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga dilakukan inkubasi pada sungkup
lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%
Identifikasi bakteri
Setelah
isolasi, bakteri yang tumbuh pada media perbenihan dilakukan identifikasi
dengan tahapan sebagai berikut:
1) Evaluasi morfologi koloni
Evaluasi morfologi koloni dengan
memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik, bundar,
berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar),
serta batas koloni (halus atau tidak beraturan)
2) Pemeriksaan mikroskopis
Pemeriksaan mikroskopis dengan cara
pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk bakteri gram positif atau
negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf), susunan
(sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)
3) Uji biokimia
Uji biokimia dilakukan untuk melihat
karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa dilakukan
diantaranya:
1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan untuk identifikasi bakteri
gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi glukosa dan sukrosa atau
laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli (acid/acid), Salmonella
thypii (alkali/acid+H2S) sedangkan Pseudomonas aerugenosa
(alkali/alkali)
2. Fermentasi karbohidrat/gula-gula
3. MR/VP (methyl red /voges proskauer)
Uji ini dilakukan untuk menentukan
organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan produk-produknya dari hasil
fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan menentukan
organism yang menghasilkan prosuk netral (asetil metal karbinol atau aseton)
dari hasil fermentasi glukosa
4. SIM(sulfur, indol, motility)
Uji ini untuk mengetahui pergerakkan
bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S
5. Simon citrate
Uji ini dilakukan untuk menentukkan
bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon
Tidak ada komentar:
Posting Komentar