Isolasi Bakteri

ISOLASI BAKTERI

ABSTRAK

       Telah dilakukan isolasi bakteri terhadap sampel air kran, air akuarium, insang ikan lele, usus ikan lele, dan ikan peda dengan media TSA (Tryptic Soy Agar)  pada tanggal 1 Juni sampai 6 Juni 2011 di Laboratorium pengolahan Jurusan Perikanan Universitas Sultan Ageng Tirtayasa. Metode yang digunakan yaitu metode penggoresan kuadran. Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Tujuan praktikum isolasi bakteri dari lngkungan akuatik adalah untuk mempelajari cara mengisolasi bakteri dari lingkungan akuatik  dengan metode penggoresan kuadran serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri tumbuh. Dimana setelah dilakukan isolasi terjadi perbedaan jumlah koloni pada air kran 13 koloni, air akuarium 40 koloni, insang ikan lele 30 koloni, usus ikan lele 3 koloni dan ikan peda tidak tumbuh koloni. Serta perbedaan ciri-ciri koloni dari ukuran yang tebal, tipis, serta warna koloni yang tumbuh pada sampel.

       Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolasi dilakukan dengan cara mengambil sampel mikroba dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian dikultur/dibiakan dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang ingin dicapai. Untuk mendapatkan atau menumbuhkan jenis mikroorganisme tertentu, maka dilakukan isolasi. Dengan isolasi inilah dapat diidentifikasi jenis bakteri tertentu baik dari kelimpahan maupun morfologinya. Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986). Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya menentukan sampel dan media apa yang akan digunakan.

       Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu sampel  tertentu. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian sedangkan sehingga individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya, dengan anggapan bahwa koloni terpisah yang tampak pada cawan petri setelah diinkubasi berasal dari satu sel tunggal. Dan metode lain yang digunakan yaitu cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta mikromanipulator (the micromanipulator method) (Lim, 1990). Isolasi bakteri dalam dunia perikanan sangat bermanfaat untuk mengidentifikasi jenis bakteri yang terdapat pada ikan terutama dalam bidang budidaya dan pengolahan. Dengan cara pengambilan sampel dari jenis ikan air tawar maupun ikan air laut. Identifikasi bakteri yang diisolasi biasa terdapat pada insang ikan, usus ikan, daging ikan maupun kondisi perairannya. Tujuan praktikum dari isolasi bakteri yaitu mempelajari cara mengisolasi bakteri dari lingkungan akuatik dengan metode penggoresan kuadran serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri tumbuh.

       Pembiakan dan identifikasi bakteri bersumber dari spesimen yang merupakan hasil proses infeksi, sedangkan infeksi itu sendiri dapat berasal dari berbagai sumber,beberapa tahapan terjadinya proses infeksi :

§ Infeksi memerlukan tempat masuk yang sesuai (port of entry) misalnya saluran pernafasan, saluran pencernaan, kontak langsung, gigitan serangga.

§ Tempat masuknya bakteri biasanya spesifik terutama untuk bakteri patogen, bakteri harus tumbuh dan berkembang dalam tubuh hospes dan menyebar melalui system limfa dan aliran darah menyebar ke seluruh jaringan,

§ Penyebaran infeksi memerlukan jalan keluar unuk menginfeksi hospes lainnya (port of exit).            Istilah mikroorganisme yang biasanya merupakan penyebab penyakit disebut patogen dan patogenitas adalah kemampuan mikroorganisme menyebabkan sakit. Virulensi berhubungan dengan derajat patogenitas bakteri. Patogenitas dan virulensi berkaitan dengan penyebaran atau toksigenitas. Penyebaran artinya kemampuan bakteri untuk masuk untuk masuk , menyebar dam berkembangbiak di dalam jaringan hospes. Toksigenitas berhubungan dengan kemampuan bakteri menghasilkan toksin. Virulensi dinyatakan dengan LD50 yaitu konsentrasi mikroorganisme yang menyebabkan 50 persen hewan percobaan sakit. Proses ketika mikroorganisme patogen masuk dikenal dengan infeksi, selama proses ini hospes dapat menjadi sakit, infeksi terselubung atau sehat menjadi carrier

Aspek patogenitas bakteri

       Patogenitas bakteri terutama disebabkan oleh adanya kapsul pada bakteri tersebut, bakteri yang tidak berkapsul lebih mudah untuk difagosit oleh sel leukosit. Hilangnya kapsul bakteri berhubungan dengan hilangnya virulensi bakteri karena kapsul diketahui sebagai faktor pengganggu. (contohnya bakteri pneumococcus)

Toksin bakteri

       Toksin bakteri diketahui memiliki peranan penting dalam kemampuan bakteri menimbulkan penyakit. Toksin dibagi dalam kelompok eksotoksin dan endotoksin.

a. Eksotoksin

Eksotoksin di hasilkan oleh bakteri ke lingkungan dan potensial serta spesifik untuk jaringan hospes, kemampuan menghasilkan eksotoksin biasanya pada bakteri gram positif batang seperti Clostridium dan Corynebacterium. Eksotoksin merupakan antigen kuat, tidak tahan panas, merupakan substansi protein, hancur oleh enzim proteolitik kecuali Clostridium botulinum, efek toksin dapat hancur oleh formalin, panas dan penyimpanan yang lama tetapi tidak untuk sifat antigeniknya, contohnya toxoid untuk program imunisasi

b. Endotoksin.

Endotoksin ditemukan intraseluler, terdapat pada dinding sel bakteri dan toksin ini dilepaskan oleh bakteri setelah bakteri hancur, endotoksin biasanya berhubungan dengan bakteri gram negatif dan bersifat antigen lemah. Endotoksin bersifat tahan terhadap panas, polisakaridanya tidak dapat dicerna oleh enzim proteolitik, endotoksin bersifat toksin lemah dan menginduksi reaksi demam pada hospes dan dapat menyebabkan syok

Enzim ekstraseluler

       Beberapa mikroorganisme memproduksi enzim ekstraseluler yang ikut berperan dalam patogenitas, enzim tersebut adalah:

a. Enzim koagulase, berhubungan dengan patogenitas Staphylococcus. Uji koagulase dilakukan menggunakan plasma menyebabkan terjadinya koagulasi.

b. Kolagenase adalah enzim yang dibentuk oleh Clostridium, bersifat dapat menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri menyebar ke jaringan

c. Hialuronidase adalah enzim yang diketahui sebagai faktor penyebaran bakteri. Enzim ini diproduksi oleh Staphylococcus, Clostridium, Streptococcus dan Pneumococcus.

d. Streptokinase dikenal pula sebagai enzim fibrinolisin, diproduksi oleh Streptococcus, Staphylococcus, dan Clostridium perfringens. Streptokinase merupakan enzim proteolitik plasma yang disebut plasmin, plasmin dapat melarutkan plasma yang terkoagulasi dan aktifitas tersebut memungkinkan bakteri menyebar

e. Hemolisin merupakan kelompok substansi terlarut yang diproduksi oleh Staphylococcus, Pneumococcus, beberapa Clostridium, dan Steptococcus, hemolisin bersifat merusak jaringan. Streptolisin memiliki kemampuan melisiskan eritrosit.

f. Leukosidin dalah substansi yang merusak leukosit, mereka diproduksi oleh streptococcus dan staphylococcus

Bakteri berdasarkan kebutuhan energi, dibagi dalam dua kelompok, yaitu

Ø Bakteri autotrof

Bakteri autotrof memperoleh energi dan tumbuh pada anorganik media, membutuhkan karbondioksida sebagai sumber karbon

Ø Bakteri heterotrof

Bakteri heterotrof mendapatkan energi dari sumber karbon organik.Bakteri heterotrof membutuhkan penambahan gula, asam amino, purin, pirimidin dan vitamin pada media kultur. Fermentasi gula merupakan sumber energi utama

Morfologi bakteri

Ukuran bakteri coccus berdiameter 1 micron (μ), bakteri batang memiliki lebar 0.5 μ dan panjang of 2 μ, sedangkan spirochaeta berbentuk ulir dengan lebar 0.2 μ dan lebar 10 μ.

Bentuk-bentuk bakteri:

Struktur bakteri

Struktur umum bakteri terdiri dari

Ø Dinding sel

Ø Membrane sitoplasma

Ø Sitoplasma

Ø Inti

Struktur khusus bakteri:

Ø Kapsul, merupakan substansi eksretori, sebagai benteng pertahanan melawan fagositosis oleh sel darah putih dan penetrasi virus

Ø Flagel , berasal dari protein elastin yang berada di sitoplasma dan keluar badan bakteri berfungsi sebagai organ pergerakan

Ø Spora, bentuk vegetatif bakteri untuk bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan

Ø Inclusion bodies, vakuola yang berfungsi sebagai tempat sisa material di sitoplasma

Metode mikroskopis adalah merupakan upaya mendapatkan informasi sementara terhadap bakteri penyebab infeksi, akan tetapi pembiakan biasanya diperlukan untuk identifikasi secara pasti dan mengenal sifat bakteri.Tujuan dari pembiakan bakteri adalah terdiri dari tiga tujuan utama yaitu:

1) Untuk menumbuhkan dan mengisolasi seluruh bakteri yang ada dalam spesimen

2) Untuk penentuan jenis bakteri mana yang pertumbuhannya paling menyerupai bakteri penyebab infeksi dan bakteri mana yang sepertinya merupakan kontaminan

3) Untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang cukup terhadap bakteri yang sesuai secara klinik sehingga dapat diidentifikasi sesuai sifat pertumbuhannya

Media perbenihan

       Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai kebutuhan bakteri. Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan nutrisi yang berbeda pula , sehingga dikembangkan berbagai macam media pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi.

       Media perbenihan terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan padat (agar). Pada media cair, bahan-bahan gizi dilarutkan dalam air sehingga pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan warna madia menjadi keruh, semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh larutan. Diperlukan jumlah bakteri 10⁶ sehingga dapat terlihat adanya pertumbuhan tanpa mikroskop. Media padat dibuat dengan penambahan bahan pengeras pada campuran bahan gizi dan air. Biasanya digunakan agarosa yang memiliki sifat cair pada suhu ≥ 95⁰C tetapi berbentuk padat pada suhu dibawah 50⁰C. Dengan kondisi inkubasi yang sesuai bakteri dapat tumbuh dan berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan bakteri membentuk kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut koloni, dengan kata lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya memiliki karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang terdiri dari satu macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni. Pembiakan yang murni diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk memudahkan pengambilan koloni yang sama ketika ditanam pada media identifikasi

Bahan-bahan media pertumbuhan

1. Bahan dasar

a. Air (H2O) sebagai pelarut

b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45⁰C.

c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.

d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.

2. Nutrisi atau zat makanan

a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg

b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.

c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah vitamin.

3. Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.

4. Bahan lain yang sering digunakan dalam pembuatan media

a. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.

b. Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta dan daging sapi.

c. Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (Bcomplex).

d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Klasifikasi dan fungsi media:

1. Medium berdasarkan sifat fisik

Ø Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelahdingin media menjadi padat..

Ø Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Ø Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)

2. Medium berdasarkan komposisi

Ø Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Ø Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak

dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Ø Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan

Ø Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

Ø Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.

Ø Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, buffer charcoal yeast extract agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain untuk pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit legionnair.

Ø Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

Ø Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,Arginine Agar.

Ø Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama tumbuh dalam media perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni, media Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.

Dari sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk identifikasi bakteri adalah :

1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.

BHI adalah media penyubur yang berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik bentuk cair maupun agar. Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah pepton, buffer posfat, dan sedikit dekstrosa. Penambahan karbohidrat memungkinkan bakteri dapat menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya digunakan untuk media pertumbuhan spesimen darah

2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth).

Media selektif gram negatif digunakan untuk pembiakan bakteri patogen saluran pencernaan ( salmonella spp dan shigella spp) dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi beberapa bahan aktif termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang menghambat pertumbuhan organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan bakteri gram negatif. Untuk mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah diinkubasi 6-8 jam setelah penanaman pertama harus diisolasi ulang dan diinkubasikan kembali, apabila melewati waktu tersebut bakteri nonenterik patogen akan tumbuh melampaui pathogen

3. Columbia CNA mengandung darah

Agar Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber pepton dan darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat membedakan reaksi bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah. CNA adalah merupakan antibiotic Colistin (C) dan Nalidixic acid (NA) yang ditambahkan ke dalam media untuk menghambat mikroorganisme gram negatif dan menumbuhkan bakteri gram positif. Contohnya untuk perbenihan Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan infeksi pada vagina dan wanita hamil.

4. Hektoen Enteric agar (HE)

      Terdiri dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue dan fuchsin acid) untuk memperlambat bakteri non patogenik gram negatif batang yang terdapat di saluran pencernaan dan memberi kesempatan salmonella dan shigella tumbuh. Media HE juga merupakan media differensial karena bakteri non enterik patogen akan tumbuh koloni berwarna oranye sampai merah muda kekuningan. Koloni ini timbul dari organisme yng memiliki kemampuan menfermentasi laktosa dalam media, kemampuan meragi menghasilkan asam yang akan menurunkan pH media dan meyebabkan perubahan indikator bromthymol blue. Shigella tidak meragi laktosa sehingga sehingga warna media biru kehijauan tidak berubah seperti karakteristik media diferensial, media mengandung feri ammonium sitrat yang mendeteksi adanya produksi gas H₂S seperti salmonella spp. Dapat terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada media.

5. Mac conkey agar

Mac conkey agar adalah media selektif dan differensial yang paling sering digunakan. Media ini terdiri dari zat warna Kristal violet untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan jamur dan memungkinkan beberapa macam bakteri gram negatif batang tumbuh , netral red sebagai pH indikator memberikan warna pink sampai merah pada koloni misalnya salmonella spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp memberikan warna koloni jernih transparan

6. Phenyl ethyl alcohol (PEA)

PEA adalah agar darah domba yang ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan nutrisi untuk bakteri gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan staphylococcus

7. Perbenihan cair tioglikolat

Perbenihan cair tioglikolat adalah media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi seperti casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat pertumbuhan , bahan lain yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi (resazurin), dextrose, vitamin K1 dan hemin biasa ditambahkan pada media modifikasi thayer martin sebagai tambahan pada media ditambahkan 0,075% untuk mencegah pengaruh oksigen langsung terhadap larutan , bahan tambahan ini diberikan untuk memberikan suasasana anaerob pada bagian dasar tabung sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh

8. Agar darah

Gambar 2. Agar darah steril (kiri), α- hemolisa (tengah) dan β-hemolisa (kanan)

Agar darah merupakan media yang paling banyak digunakan unuk penanaman bakteri yang sukar tumbuh karena pada agar darah domba mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri. Kemudian pula koloni yang tumbuh pada media ini biasanya spesifik dan mudah dikenali. Media pada dasarnya terdiri dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan (mengandung KH),NaCl, agar dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim ekstraseluler yang dapat melisiskan sel darah merah domba pada agar (hemolisis). Aktifitas ini ditandai dengan adanya zona jernih disekeliling koloni (beta hemilisis), kehijauan (alpha hemolisis) dan untuk bakteri yang tidak menghemolisa darah tidak terjadi perubahan pada sekeliling koloni bakteri ( gamma /non hemolisis)

9. Agar coklat dan Thayer martin

Agar coklat sama seperti agar darah tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan terlebih dahulu sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit mengeluarkan bahan-bahan intraseluler seperti haemoglobin, hemin,dan koenzim nicotinamide adenine dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna coklat pada media sehingga disebut dengan agar coklat. Biasanya bakteri patogen yang tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus spp (terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga)

Agar Thayer martin

Thayer martin agar adalah media diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae. Penambahan antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif, vancomisin untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan ragi. Antibiotik trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus spp, dan bakteri lainnya yang akan tumbuh menyebar di seluruh permukaan agar dan dapat meghalangi koloni bakteri yang akan diidentifiasi Neisseria spp. pada mredia modifkasi Thayer martin lewis, antibiotik nistatin diganti dengan ansamisin

Sterilisasi media

Bahan media yang telah dilarutkan , baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan terlebih dahulu melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121⁰C (250⁰F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi² (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama 15 menit. dan waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121⁰ C . Setelah di autoclave media harus mencapai suhu sekurangnya 50 ⁰C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya 25 ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti darah, antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin sebelum dituang ke cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi dengan cara filtrasi membran

Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba

Kondisi lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu:

a) Tersedianya oksigen atau karbondioksida

Kebanyakan bakteri klinik adalah terdiri dari bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob obligat. Bakteri aerob adalah bakteri yang menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron. Bakteri anaerob fakultatif dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Tetapi untuk bakteri seperti Pseudomonas spp, Neisseria spp, Bordetela spp, Brucella spp dan Francisella spp adalah bakteri obligat aerob yaitu bakteri yang tidak dapat tumbuh tanpa ada oksigen. Sedangkan bakteri yang membutuhkan oksigen dalam jumlah sedikit disebut bakteri mikroaerofilik

b) Suhu

Bakteri pathogen biasanya tumbuh sangat baik pada suhu yang sama dengan suhu jaringan dan organ tubuh hospes yaitu 37C walaupun demikian suhu pembiakan biasanya berada pada rentang 35-37C. akan tetapi beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya mislnya: campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia enterocolitica (dapat tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C

c) pH

pH adalah pengukuran konsentrasi ion hydrogen pada lingkungan mikroorganisme.nilai pH 7 menunjukkan kondisi netral, sedangkan pH lebih kecil dari 7 disebut asam dan lebih besar dari 7 disebut basa. Kebanyakan bakteri klinik menyukai kondisi pH diantara pH netral sekitar 6,7-7,5, kebanyakan media yang diperjualbelikan telah mengandung buffer sehingga pengecekan ph sudah tidak diperlukan lagi

d) Kelembaban

Air merupakan komponen yang sudah terdapat dalam media, baik pada media padat ataupun cair tapi untuk penyimpanan dalam jangka waktu yang lama saat pembiakan bakteri akan menyebabkan kehilangan sebagian besar kadar air yang timbul karena proses evaporasi. Kehilangan air dari media dapat mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu:

o berkurangnya air yang merupakan komponen penting yang akan digunakan untuk metabolisme bakteri

o dengan berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam media akan meningkat, dengan meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan meningkatkan tekanan osmotik sehingga akan menekan sel bakteri dan sel akan lisis

Isolasi bakteri

Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi (lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri

Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.

Inkubasi

Metode-metode yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi :

inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-37⁰C) dan kelembaban udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5%

untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga dilakukan inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%

Identifikasi bakteri

Setelah isolasi, bakteri yang tumbuh pada media perbenihan dilakukan identifikasi dengan tahapan sebagai berikut:

1) Evaluasi morfologi koloni

Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik, bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas koloni (halus atau tidak beraturan)

2) Pemeriksaan mikroskopis

Pemeriksaan mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf), susunan (sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)

3) Uji biokimia

Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa dilakukan diantaranya:

1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)

Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi glukosa dan sukrosa atau laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli (acid/acid), Salmonella thypii (alkali/acid+H₂S) sedangkan Pseudomonas aerugenosa (alkali/alkali)

2. Fermentasi karbohidrat/gula-gula

3. MR/VP (methyl red /voges proskauer)

Uji ini dilakukan untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan produk-produknya dari hasil fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan menentukan organism yang menghasilkan prosuk netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari hasil fermentasi glukosa

4. SIM(sulfur, indol, motility)

Uji ini untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H₂S

5. Simon citrate

Uji ini dilakukan untuk menentukkan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon